依據(jù)《中藥復(fù)方制劑整體質(zhì)量評價(jià)體系的構(gòu)建及應(yīng)用》中關(guān)于構(gòu)建中藥復(fù)方制劑整體質(zhì)量評價(jià)體系的技術(shù)路線，按照《達(dá)立通顆粒整體質(zhì)量研究方案》，開展達(dá)立通顆粒整體質(zhì)量評價(jià)研究，包括研發(fā)立項(xiàng)研究、組方和方解研究、中藥材/飲片質(zhì)量研究、生產(chǎn)過程控制技術(shù)研究、作用機(jī)制研究、質(zhì)量標(biāo)志物和生物標(biāo)志物研究、循證醫(yī)學(xué)研究、藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)研究。根據(jù)項(xiàng)目進(jìn)展情況，我們將陸續(xù)報(bào)道相關(guān)研究成果。

本期介紹2023年度達(dá)立通顆粒促進(jìn)胃腸動力的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與主要促胃腸動力藥效成分及PK-PD標(biāo)志物研究成果總結(jié)。

摘要

借助HPLC-Q-TOF/MS 高通量測定技術(shù)分析達(dá)立通顆粒中的小分子成分，鑒定出108個(gè)化合物，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析達(dá)立通顆粒作用的通路與靶標(biāo)。以功能性消化不良（FD）胃腸推進(jìn)率為考察指標(biāo)和因變量 Y，以不同提取方式下達(dá)立通顆粒的提取物小分子化合物及豐度為自變量 X，應(yīng)用主成分分析（PCA）、灰色關(guān)聯(lián)分析（GRA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）三種分析方法，建立達(dá)立通顆粒與FD之間的譜效關(guān)聯(lián)，篩選出達(dá)立通顆粒調(diào)節(jié)胃腸動力的10個(gè)主要成分。進(jìn)一步在斑馬魚蠕動模型中進(jìn)行研究和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)桔皮素、川陳皮素、橙皮苷等具有顯著的促進(jìn)斑馬魚胃腸道蠕動效果，提示為達(dá)立通顆粒藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和促進(jìn)胃腸動力主要藥效成分及PK-PD標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞

達(dá)立通顆粒；胃腸動力；斑馬魚模型；桔皮素；川陳皮素；橙皮苷

1、研究目標(biāo)

研究達(dá)立通顆粒中促進(jìn)胃腸動力的物質(zhì)成分群與主要藥效成分和PK-PD標(biāo)志物。

2、研究方法

2.1 儀器與試劑

AB Sciex Triple TOFTM 5600質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司），LC-20A快速液相儀（日本Shimadzu公司），Milli-Q超7純水機(jī)（美國Millipore公司）。

乙腈、甲醇（色譜純，德國默克公司），甲酸（色譜純，阿拉丁試劑有限公司），乙醇（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司），石油醚、乙醚、乙酸乙酯和正丁醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.2.1 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

首先通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取60個(gè)達(dá)立通顆粒給

藥后進(jìn)入胃腸道的成分的SMILE號，錄入Swiss Target Prediction數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）（選擇“Homo sapiens”）中導(dǎo)出其預(yù)測的各胃腸成分的相關(guān)作用靶點(diǎn)，建立“有效成分-靶點(diǎn)”對應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。隨后將該網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件完成達(dá)立通顆粒促胃腸動力成分對FD作用的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。最后，基于各成分的Degree值對達(dá)立通顆粒促胃腸動力成分進(jìn)行排序。

2.2.2 藥物、疾病交集靶點(diǎn)獲取與匹配

在OMIM（https：//www.omim.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/，選擇relevance score>2）三個(gè)數(shù)據(jù)庫中分別輸入“Functional dyspepsia”分別獲得與FD相關(guān)作用靶點(diǎn)，整合3個(gè)數(shù)據(jù)庫信息以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，得到與FD相關(guān)的靶點(diǎn)信息。然后通過 Excel對上述成分對應(yīng)靶點(diǎn)和疾病對應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行Venn （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）分析，得到達(dá)立通顆粒作用于FD的靶點(diǎn)。

2.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將上述2.1.2項(xiàng)下交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），剔除孤立靶點(diǎn)（hightest confidence選擇0.9000）后導(dǎo)出TSV文件格式的蛋白互作（Protein-Protein Interaction,PPI）信息，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出與FD相關(guān)的前10個(gè)的核心靶點(diǎn)。

2.2.4 KEGG富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/，選擇“OFFICIAL-GENE SYMBOL”，輸入“homo sapiens”并設(shè)置P<0.05）進(jìn)行京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析。根據(jù)靶點(diǎn)富集程度排列數(shù)據(jù)，篩選出最相關(guān)的30條通路，并在微生信平臺（https：//www.bioinformatics.com.cn/）對其進(jìn)行可視化。

2.3 樣品采集與制備

2.3.1 供試品溶液的制備

稱取15份57.5g達(dá)立通顆粒（相當(dāng)于100g生藥材），分別用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和75%乙醇等五種不同溶劑提取（n=3）。3倍體積溶劑提取三次后合并提取液，分別濃縮至100mL（即生藥濃度約1g/mL）。各取1mL揮干，加入800μL甲醇并超聲振蕩30min，12000 rpm 離心10min后，分別收集所有樣品的上清液進(jìn)樣。剩余提取物揮干，重新溶解在0.5%CMC-Na 溶液中4℃保存待用。

2.3.2 達(dá)立通顆粒藥液的配制

達(dá)立通顆粒高、中和低劑量組藥液的配制：分別稱取8.82 g、5g和2.5g達(dá)立通顆粒，研磨成粉后加入10.5mL、8.9mL、和9.6mL純水后超聲振蕩30min，冷卻后置于4℃冰箱保存待用。

2.3.3 對照品溶液的制備

參照前期研究資料配制。

2.3.4 實(shí)驗(yàn)飼料的配制

10gCMC-Na充分溶于200 mL熱水中制成透明黏稠半固體，依次加入16g脫脂奶粉和8g蔗糖，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，加?g活性碳，配制成250mL最終比重為1.1g/mL的黑色半固體糊狀實(shí)驗(yàn)餐。

2.4 動物實(shí)驗(yàn)

2.4.1 給藥方案

取由上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)動物經(jīng)營部（中國上海）提供的24只體重為18g～22g的雄性ICR小鼠（實(shí)驗(yàn)動物許可證編號為SYXK（滬）-2018-0002。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間自由飲食飲水，自動開關(guān)燈模擬正常晝夜交替。小鼠隨機(jī)分為4組（n=6），空白組（CON）、達(dá)立通顆粒高劑量組（DLT-H：10.5g/kg）、中劑量組（DLT-M：5.2g/kg）和低劑量組（DLT-L：2.6g/kg）。

另取由上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)動物經(jīng)營部（中國上海）提供的110只體重為18g～22g的雄性ICR小鼠（實(shí)驗(yàn)動物許可證編號為SYXK（滬）-2018-0006）。所有動物飼養(yǎng)均參照上述方法。隨后將小鼠隨機(jī)分為11組（n=10），空白組、達(dá)立通顆粒不同溶劑提取液組（石油醚組-PE、乙醚組-EE、乙酸乙酯組-EA、正丁醇組-NB、水提醇沉組-WEAP，各組分別n=2），按達(dá)立通顆粒高劑量（10.5g/kg）給藥，每天1次，連續(xù)7天。

2.4.2 胃腸推進(jìn)考察

按動物實(shí)驗(yàn)流程圖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在最后一次給藥前18h禁食不禁水，給藥后45min各組動物均給予0.4mL實(shí)驗(yàn)餐，20min后脫頸處死動物，解剖后迅速打開小鼠腹腔，按腸推進(jìn)考察方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄為L小前和L小總并代入公式。

小腸推進(jìn)率=L小前/L 小總×100 %。

2.5 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜柱：Hypersil GOLDTM 色譜柱（100mm×2.1mm, 3m），柱溫：40℃，流動相A為0.1%甲酸水（v/v），流動相B為乙腈。流速為0.4 mL/min ，進(jìn)樣量為3 μL。梯度洗脫程序：0～5 min，10% B；5～44 min，90% B；44～46 min，90% B；46～47 min，90-10% B；47～50.1 min，10% B。

電噴霧離子源（ESI），離子源溫度（TEM）550℃，氣簾氣（CUR）40psi，霧化氣（GS1）55psi，輔助加熱氣（GS2）55 psi，離子源噴霧電壓（IS）5500V/-5500V，碰撞電壓（CE）10V/-10V，去簇電壓（DP）100V/-100V，掃描范圍為m/z50～1500。

2.6 數(shù)據(jù)處理

以前期所鑒定的達(dá)立通顆粒中的108個(gè)化學(xué)成分為基礎(chǔ)，確定各不同提取溶劑提取的化學(xué)成分并進(jìn)行編號。隨后，采用多種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立上述質(zhì)譜數(shù)據(jù)和胃腸推進(jìn)指標(biāo)的聯(lián)系以篩選達(dá)立 通顆粒的潛在促胃腸動力成分。采用MetaboAnalyst 5.0 （https：//www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml）進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis, PCA），采用Excel進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析（GreyRelational Analysis,GRA）和SIMCA14軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）。

2.7 達(dá)立通顆粒中潛在促胃腸動力成分對斑馬魚腸道蠕動的影響

斑馬魚消化道的解剖結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)與人類消化道相似，具有同心圓層的內(nèi)上皮、結(jié)締組織、環(huán)狀肌肉和外縱肌層。因此，可利用斑馬魚模型評價(jià)調(diào)節(jié)胃腸功效。

2.7.1 最大耐受濃度測定

隨機(jī)選取受精后6d的斑馬魚胚胎于24孔板中，每孔10尾，分別加入1mL的藥物（桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陳皮素、川陳皮素、延胡索堿、橙皮苷、金絲桃苷、檸檬苦素、四氫小檗堿），同時(shí)設(shè)置對照組（不含藥物）。處理24h后，觀察并記錄斑馬魚的死亡情況，確定各藥物對斑馬魚的最大耐受濃度。

2.7.2 斑馬魚腸道蠕動模型的建立及給藥

將5d齡的野生型AB斑馬魚置于24孔板中，每孔15尾，設(shè)置對照組、模型組、多潘立酮（30μg/mL）組、桔皮素（20μM/mL）組、延胡索乙素（37.5μM/mL）組、去甲基川陳皮素（10μM/mL）組、川陳皮素（12.5μM/mL）組、延胡索堿（37.5μM/mL）組、橙皮苷（200μM/mL）組、金絲桃苷（300μM/mL）組、檸檬苦素（200μM/mL）組、四氫小檗堿（75μM/mL）組。各組加入1mL 尼羅紅（10μg/mL），作用16h后清洗3遍。除對照組外，其余各組給予1mL鹽酸洛哌丁胺（20μg/mL）造模，對照組用胚胎培養(yǎng)水正常培養(yǎng)。造模同時(shí)，各給藥組給予1mL相應(yīng)濃度的藥物，對照組和模型組給予等體積胚胎培養(yǎng)水，于28℃恒溫水浴避光培養(yǎng)24h。

2.7.3 斑馬魚的腸蠕動促進(jìn)率測定

給藥24h后，用 0.02%三卡因進(jìn)行麻醉。各組隨機(jī)選取10尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下對胃腸部進(jìn)行拍照，計(jì)算斑馬魚腸道內(nèi)容物（尼羅紅）平均熒光強(qiáng)度（Mean），用Image J圖像處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算腸蠕動促進(jìn)率。

腸蠕動促進(jìn)率＝1－（Mean給藥－Mean對照）/（Mean模型－Mean對照）

3、結(jié)果

3.1 達(dá)立通顆粒治療FD的作用靶點(diǎn)及關(guān)鍵成分

3.1.1 成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索并去重后，成功找到藥物靶標(biāo)688個(gè)的“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。該圖共有60個(gè)達(dá)立通顆粒入胃腸道的活性成分，包含750個(gè)節(jié)點(diǎn)和4165 條邊，連線表明達(dá)立通顆粒促胃腸動力有效成分與靶點(diǎn)之間的靶向關(guān)系。

3.1.2 達(dá)立通顆粒作用于 FD 的靶點(diǎn)

三個(gè)數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)搜索、篩選以及合并去重后得到達(dá)立通顆粒與FD密切相關(guān)的靶標(biāo)共1964 個(gè)。與成分對應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行Venn 分析并導(dǎo)出獲得的308個(gè)共同靶點(diǎn)，該靶點(diǎn)即是達(dá)立通顆粒對FD起治療作用密切相關(guān)的靶點(diǎn)。

3.1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)、關(guān)鍵成分的挖掘

PPI網(wǎng)絡(luò)圖以達(dá)立通顆粒有效成分治療FD的266個(gè)靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，以1556條靶點(diǎn)間的相互作用為邊。其粗細(xì)與相互作用的強(qiáng)弱成正比，大小與該靶點(diǎn)的Degree值成正比，邊代表以度值、介數(shù)和接近中心性3個(gè)參數(shù)為基礎(chǔ)，選取中值以上的靶點(diǎn)作為潛在靶點(diǎn)，排在前10位的靶點(diǎn)有SRC、TP53、HSP90AA1、PIK3R1、STAT3、PIK3CA、MAPK3、MAPK1、HRAS和AKT1。

按達(dá)立通顆粒有效成分的 Degree值排序。以達(dá)立通顆粒治療FD的前10位核心靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，根據(jù)度值大小，將核心靶點(diǎn)對應(yīng)的達(dá)立通顆粒胃腸有效成分進(jìn)行排序。

結(jié)果表明，包括：川陳皮素、甜橙黃酮、金絲桃苷、桔皮素、檸檬苦素、橙皮苷、紫堇鱗莖堿、延胡索乙素、去甲基川陳皮素、四氫小檗堿、藥根堿、小檗堿、芹菜素和環(huán)氧橙皮油內(nèi)酯等成分排名靠前，為達(dá)立通顆粒治療FD的關(guān)鍵成分。

3.1.4 KEGG富集分析

KEGG通路富集圖分析結(jié)果表明，與FD密切相關(guān)的富集信號通路主要包括圖中所示的前三十條。如PI3K-Akt信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、局灶性粘連、Ras信號通路、AGE-RAGE信號通路、Rap1信號通路、5-HT相關(guān)神經(jīng)突觸、化學(xué)致癌作用-受體激活、化學(xué)致癌作用-活性氧、FoxO信號通路、趨化因子信號通路、cAMP-鈣信號通路。其中值得關(guān)注的是血清素能突觸、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路和鈣信號通路等，近幾年逐漸被學(xué)者考慮用于FD的機(jī)制研究。

3.2 不同溶劑提取達(dá)立通顆粒的圖譜生成

基于前期工作，本研究鑒定出的108個(gè)常見峰的成分，建立了5個(gè)不同組分提取達(dá)立通顆粒的HPLC-Q-TOF/MS的指紋圖譜。首先，通過參考文獻(xiàn)和 TCMSP數(shù)據(jù)庫建立了達(dá)立通顆粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)庫。其次，利用 HPLC-Q-TOF-MS/MS對各達(dá)立通顆粒提取液內(nèi)的化學(xué)成分進(jìn)行收集，利用PeakView中的XIC對各達(dá)立通顆粒提取物的指紋圖譜進(jìn)行分析?？梢钥闯?，達(dá)立通顆粒中108個(gè)化合物在不同組分中的數(shù)量分布差別較大，且不同組分之間的豐度（即含量）也存在差異。

3.2 達(dá)立通顆粒對正常小鼠腸道推進(jìn)率的影響

3.2.1.達(dá)立通顆粒對正常小鼠小腸推進(jìn)率的影響

達(dá)立通顆粒對正常小鼠小腸推進(jìn)率的影響研究結(jié)果表明，與空白組相比，達(dá)立通顆粒給藥組小鼠小腸推進(jìn)率增加，中劑量和高劑量給藥達(dá)立通組具有顯著性差異，特別是高劑量（10.5g/kg）給藥促胃腸動力效果最好（****P<0.0001）。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10.5g/kg（以生藥量計(jì)）給藥。

3.2.2 不同溶劑提取達(dá)立通顆粒對正常小鼠小腸推進(jìn)率的影響

對達(dá)立通顆粒用不同溶劑提取后的組分進(jìn)行試驗(yàn)，考察對正常小鼠小腸推進(jìn)率。結(jié)果表明，各組較空白組胃腸推進(jìn)均有提高，其中石油醚組、乙醚組和乙酸乙酯組給藥后小鼠促胃腸動力有不同程度的提升，但不具有顯著性差異；正丁醇組給藥小鼠促胃腸動力與空白組相比具有差異（*P <0.05），水提醇沉組小腸推進(jìn)率也顯著升高**P＜0.01），表明水提醇沉處理方式促胃腸動力效果最接近與達(dá)立通顆粒給藥。

3.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

3.3.1 PCA分析

PCA是在無監(jiān)督模式下進(jìn)行的多元統(tǒng)計(jì)分析，其貢獻(xiàn)率是指主成分的方差在被研究的變量總方差中所占的比例。故主成分的貢獻(xiàn)率越高，其所包含樣本的代表性就越高。本研究利用MetaboAnalyst 5.0網(wǎng)站（https：//www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml）分析達(dá)立通顆粒不同溶劑提取部位的原型成分差異。結(jié)果表明，前三個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率高達(dá)80%（PC1+PC2+PC3=81.70 %），因此這三個(gè)主成分可代替 5 個(gè)不同溶劑提取達(dá)立通顆粒的大部分信息，可以解釋108個(gè)峰的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

按照各成分響應(yīng)強(qiáng)度柱狀堆疊圖，結(jié)合各成分的PCA載荷量篩選對達(dá)立通顆粒的質(zhì)量影響較大的成分。結(jié)果表明，達(dá)立通顆粒中黃酮類成分和生物堿類成分含量較高且載荷量較大，可作為達(dá)立通顆粒的主要成分。包括：桔皮素、川陳皮素、5-羥基-3,6,7-8,3'-4'-六甲氧基黃酮、甜橙黃酮、別隱品堿、延胡索堿、巴馬汀、延胡索乙素、原阿片堿、元胡寧、去甲基川陳皮素、去氫海罌粟堿、檸檬苦素、香葉木苷、四氫非洲防己堿、橙皮苷、野漆樹苷、藥根堿、蕓香柚皮苷、雞矢藤苷酸、高圣草素、金絲桃苷、紫堇鱗莖堿、環(huán)氧香檸檬素、車葉草苷酸、橙皮素、去氫木香內(nèi)酯、香風(fēng)草苷、5-羥基-3-7-8-3'-4'-五甲氧基黃酮、黃連堿、新圣草苷、柚皮苷、香葉木素-7-O-葡萄糖苷、木香烴內(nèi)酯、蘆丁、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、圣草次苷、檳榔堿和四氫小檗堿共計(jì)39個(gè)成分。

3.3.2 GRA分析

GRA也屬于一種基于原始數(shù)據(jù)采用均值變化法進(jìn)行無量綱處理的多因素統(tǒng)計(jì)分析方法。本研究將小鼠藥效指標(biāo)小腸推進(jìn)率作為母序列，5 個(gè)不同溶劑提取達(dá)立通顆粒的108個(gè)化合物的峰面積作為子序列，計(jì)算關(guān)聯(lián)度（r）。r 越大，表明該成分與胃腸推進(jìn)的關(guān)聯(lián)越大。本研究根據(jù)r≥0.75進(jìn)行篩選，共篩選出43個(gè)與胃腸推進(jìn)相關(guān)性較大的化合物，包括：川陳皮素、柚皮素、橙皮素、槲皮素、木香烴內(nèi)酯、延胡索堿、桔皮素、延胡索乙素、檸檬苦素、去甲基川陳皮素、紫堇鱗莖堿和橙皮苷等黃酮和生物堿類化合物。雖然GRA可以非常快速的篩選出跟目標(biāo)藥效相關(guān)的有效成分。但是也存在一些缺點(diǎn)，計(jì)算出的r均為正數(shù)，其數(shù)值的大小只能反映化合物與藥效相關(guān)性大小，并不能反映呈負(fù)相關(guān)的那部分化學(xué)物，所以并不能單純的使用GRA一種方法來評價(jià)單味藥或復(fù)方中全部化合物對藥效指標(biāo)的綜合貢獻(xiàn)。

3.3.3 OPLS-DA分析

OPLS-DA是基于PLS，把連續(xù)的變量正交（orthogonal）投射到latent structure，從而把變量分成了可以預(yù)測的和無關(guān)的兩種，也屬于多因素統(tǒng)計(jì)分析方法之一。不同溶劑提取達(dá)立通顆粒 OPLS-DA、VIP值排序圖、載荷散點(diǎn)圖和置換檢驗(yàn)拼合圖。由此可知OPLS-DA模型將不同溶劑提取的樣本區(qū)分開來，且擬合模型預(yù)測成分的累計(jì)統(tǒng)計(jì)量R2X=0.921、模型解釋率參數(shù)R2Y=0.998、預(yù)測能力參數(shù)Q2=0.980，均高于0.5，表示 OPLS-DA模型對達(dá)立通顆粒藥效物質(zhì)的分析預(yù)測能力較好。此外本研究還進(jìn)行OPLS-DA模型驗(yàn)證（置換檢驗(yàn)n=200），發(fā)現(xiàn) R2=0.806、Q2=-1.16，右側(cè)的R2和Q2均高于左側(cè)，且Q2與Y軸交于負(fù)半軸，說明該模型可靠，不存在過擬合現(xiàn)象。

計(jì)算化學(xué)成分與藥效指標(biāo)的VIP值，根據(jù)VIP值＞1 進(jìn)行篩選，共篩選出25個(gè)與藥效指標(biāo)小腸推進(jìn)率相關(guān)性較強(qiáng)的成分，包括：桔皮素、5-羥基-3,6,7-8,3'-4'-六甲氧基黃酮、延胡索乙素、別隱品堿、巴馬汀、去甲基川陳皮素、川陳皮素、橙皮苷、木香烴內(nèi)酯、延胡索堿、檸檬苦素和紫堇鱗莖堿等，主要為黃酮和生物堿類的化合物。

3.3.4 統(tǒng)計(jì)分析總結(jié)

根據(jù)PCA、GRA 和 OPLS-DA 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，篩選出10個(gè)化合物可能是達(dá)立通顆粒調(diào)節(jié)胃腸動力的主要活性成分，包括：桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陳皮素、川陳皮素、延胡索堿、橙皮苷、金絲桃苷、紫堇鱗莖堿、檸檬苦素和四氫小檗堿。

3.4 基于斑馬魚蠕動模型的達(dá)立通顆粒中潛在促胃腸動力成分的效應(yīng)驗(yàn)證

在前期篩選出的10種化學(xué)成分中，紫堇鱗莖堿無法購買到相應(yīng)的對照品，我們僅僅測試了其余9種成分對斑馬魚腸蠕動的影響。

我們首先測試了不同濃度的上述成分對斑馬魚死亡率的影響。結(jié)果表明，桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陳皮素、川陳皮素、延胡索堿、橙皮苷、金絲桃苷、檸檬苦素和四氫小檗堿的最大耐受劑量分別為20μg/mL、37.5μg/mL、10μg/mL、12.5μg/mL、37.5μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、200μg/m、75μg/mL。

達(dá)立通顆粒中潛在促胃腸動力成分的效應(yīng)驗(yàn)證結(jié)果表明，與對照組比較，模型組斑馬魚腸道內(nèi)容物熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；除延胡索乙素外，其余達(dá)立通顆粒各給藥組斑馬魚腸道內(nèi)容物熒光強(qiáng)度與模型組比較明顯降低。經(jīng)計(jì)算各組斑馬魚的胃腸道蠕動促進(jìn)率，發(fā)現(xiàn)桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陳皮素、川陳皮素、延胡索堿、橙皮苷、金絲桃苷、檸檬苦素和四氫小檗堿的胃腸蠕動促進(jìn)率分別為90.90%（p< 0.01）、6.48%（p＞0.05）、54.55%（p< 0.01）、88.55%（p< 0.01）、45.92%（p<0.05）、65.07%（p<0.01）、50.65%（p< 0.01）、36.17%（p<0.05）和 51.86%（p<0.01）。其中延胡索乙素未見明顯的促胃腸道蠕動能力，其余各成分的促胃腸道蠕動能力依次為桔皮素>川陳皮素>橙皮苷>去甲基川陳皮素≈四氫小檗堿≈金絲桃苷>延胡索堿>四氫小檗堿。

4、結(jié)論與討論

采用高通量測定技術(shù)分析和鑒定達(dá)立通顆粒中108個(gè)小分子化合物，采用多模式譜效關(guān)聯(lián)分析篩選出達(dá)立通顆粒調(diào)節(jié)胃腸動力的10個(gè)主要成分：桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陳皮素、川陳皮素、延胡索堿、橙皮苷、紫堇鱗莖堿、金絲桃苷、檸檬苦素和四氫小檗堿。斑馬魚模型研究發(fā)現(xiàn)桔皮素、川陳皮素、橙皮苷等具有顯著的促進(jìn)斑馬魚胃腸道蠕動效果，提示為達(dá)立通顆粒主要藥效成分。

考慮到中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對達(dá)立通顆粒中的潛在活性成分進(jìn)行了研究。PPI網(wǎng)絡(luò)、KEGG通路富集結(jié)果為其后續(xù)藥理機(jī)制研究提供了新的思路。另外，篩選出包括川陳皮素、甜橙黃酮、金絲桃苷、桔皮素、檸檬苦素、橙皮苷、紫堇鱗莖堿、延胡索乙素、去甲基川陳皮素、四氫小檗堿、藥根堿、小檗堿、芹菜素和環(huán)氧橙皮油內(nèi)酯等化合物作為達(dá)立通顆粒治療FD的關(guān)鍵成分。值得注意的是，針對目前文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道達(dá)立通顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在促胃腸動力成分，還需要相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。

“譜-效”關(guān)聯(lián)分析可快速發(fā)現(xiàn)中藥藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。多種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法聯(lián)用在利用譜效關(guān)系篩選中藥有效活性成分方面起到了至關(guān)重要的作用。本研究通過三種統(tǒng)計(jì)分析方法聯(lián)用，以FD經(jīng)典臨床癥狀胃腸推進(jìn)障礙為藥效指標(biāo)，建立達(dá)立通顆粒與FD之間的譜效關(guān)聯(lián)，篩選了不同溶劑提取的達(dá)立通顆粒治療FD促進(jìn)胃腸運(yùn)動的關(guān)鍵活性成分。根據(jù)各成分的載荷量、關(guān)聯(lián)度和VIP值，篩選出以下10個(gè)成分，包括：桔皮素、延胡索乙素、去甲基川陳皮素、川陳皮素、延胡索堿、橙皮苷、金絲桃苷、紫堇鱗莖堿、檸檬苦素和四氫小檗堿，作為達(dá)立通顆粒治療FD的潛在促胃腸動力成分。進(jìn)一步在斑馬魚腸蠕動模型中確證了其中8種成分具有較好的促胃腸道蠕動能力。

 

本文僅供專業(yè)人士參考。

 

本文綜合整理自南昌弘益藥物研發(fā)團(tuán)隊(duì)，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)，禁止轉(zhuǎn)載，轉(zhuǎn)載授權(quán)請聯(lián)系0791-88161315。