采用UPLC-Q-TOF/MS/MS對達(dá)立通顆粒體內(nèi)外化學(xué)成分進(jìn)行分析,非目標(biāo)特征濾波器分析并結(jié)合計
發(fā)布時間:2022-10-11 15:46:00 | 來源:【藥物研發(fā)團(tuán)隊 2022-10-11】
采用UPLC-Q-TOF/MS/MS對達(dá)立通顆粒體內(nèi)外化學(xué)成分進(jìn)行分析,非目標(biāo)特征濾波器分析并結(jié)合計算機預(yù)測策略對其化學(xué)成分和體內(nèi)代謝物進(jìn)行鑒定
Yan Su,Lin Tao,Xiaoli Zhang,Xianjie Sheng,Qin Li,Wenying Fei,Tao Yin,An Kang,Jiye Aa,Guangji Wang
PII:S0731-7085(22)00507-6
DOI:https://doi.org/10.1016/j.jpba.2022.115086
引用:PBA115086
引用出處:Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
接收日期:2022.05.17
修正日期:2022.09.24
接受日期:2022.09.27
引用本文為:Yan Su,Lin Tao,Xiaoli Zhang,Xianjie Sheng,Qin Li,Wenying Fei,Tao Yin,An Kang,Jiye Aa,Guangji Wang,《達(dá)立通顆粒體內(nèi)外化學(xué)成分的超高效液相色譜-Q-TOF/MS/MS分析方法及其在體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究》,《醫(yī)藥與生物醫(yī)學(xué)分析雜志》,(2022)doi:https://doi.org/10.1016/j.jpba.2022.115086
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采用 UPLC-Q-TOF/MS/MS對達(dá)立通顆粒體內(nèi)外化學(xué)成分進(jìn)行分析,非目標(biāo)特征濾波器分析并結(jié)合計算機預(yù)測策略對其化學(xué)成分和體內(nèi)代謝物進(jìn)行鑒定
Yan Su1,Lin Tao2,Xiaoli Zhang2,Xianjie Sheng1,Qin Li1,Wenying Fei1,Tao Yin1,An Kang1*,Jiye Aa3**,Guangji Wang3
1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京210023;
2.南昌弘益藥業(yè)有限公司,南昌330006;
3.中國藥科大學(xué)代謝組學(xué)實驗室,江蘇省藥物代謝與藥代動力學(xué)重點實驗室,江蘇南京210009
頁眉標(biāo)題:達(dá)立通顆粒體內(nèi)外化學(xué)成分分析
通訊作者:
*An Kang:南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京仙林大道138號,210023,中國,Email:kanga@njucm.edu.cn
** Jiye Aa:中國藥科大學(xué)藥物代謝與藥代動力學(xué)重點實驗室,南京佟家巷24號,南京210009,中國,Email:jiyea@cpu.edu.cn
摘要
達(dá)立通顆粒,作為一種強效胃腸動力中藥,臨床上用于治療功能性消化不良。對緩解胃腸動力障礙有較好的療效,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而,目前對其體內(nèi)外化學(xué)分析還沒有全面的研究。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS結(jié)合非靶向特征過濾分析和計算機預(yù)測策略(NCFS),推導(dǎo)和鑒別大鼠口服達(dá)立通顆粒后生物樣品中的化學(xué)成分和體內(nèi)代謝產(chǎn)物。本研究從達(dá)立通顆粒中鑒定出108種化學(xué)成分,其中黃酮類化合物50種,生物堿22種,萜類13種,有機酸11種,香豆素10種,揮發(fā)油2種。在大鼠給藥后的血漿、組織、尿液和糞便樣本中,共推測出147個化合物(60個原型化合物,87個代謝物)。體內(nèi)代謝途徑主要有甲基化、去甲基化、去糖基化、氫化、羥基化、磺化、葡糖苷醛化等??傊_(dá)立通顆粒中存在大量的黃酮類化合物。綜上所述,采用快速、準(zhǔn)確的分析方法對達(dá)立通顆粒的化學(xué)成分和代謝物進(jìn)行了全面的鑒定,為其生物活性物質(zhì)的分析奠定了基礎(chǔ)。為深入研究達(dá)立通顆粒藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)及進(jìn)一步綜合開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。
關(guān)鍵詞:達(dá)立通顆粒,化學(xué)成分,代謝物,高分辨質(zhì)譜
1.引言
胃弱又稱消化不良,已經(jīng)越來越普遍了,可分為兩類:“器質(zhì)性”消化不良和功能性消化不良(FD)[1]。FD是臨床常見的功能性胃腸疾病,是指以胃脘痛、餐后加重的胃脘脹、早飽、噯氣、食欲不振、惡心、嘔吐等消化不良癥狀的疾病[2,3]。達(dá)立通顆粒是由柴胡、枳實、木香、陳皮、清半夏、蒲公英、山楂、焦檳榔、雞矢藤、黨參、延胡索、六神曲12種中藥材組成[4],是目前應(yīng)用最廣泛的促胃腸動力中藥之一。柴胡是達(dá)立通顆粒的主藥,主要治療胃腸氣和飲食積累,可改善功能性消化不良患者的臨床癥狀。枳實具有化氣清積、化痰祛斑的作用[5];木香能止痛,用于胃脾氣郁滯引起的腹脹、噯氣、食欲不振等癥狀[6];陳皮、檳榔子、山楂、延胡索具有降逆氣、和胃、消滯的作用[7,8]。
臨床研究結(jié)果表明,與化學(xué)藥物多潘立酮和西沙必利相比,達(dá)立通顆粒具有促進(jìn)胃排空、腸運動、止吐和鎮(zhèn)痛的作用。目前,達(dá)立通通聯(lián)合其他方法治療胃腸疾病的報道較多,但對其化學(xué)成分分析和鑒定的綜合報道較少。因此,建立達(dá)立通顆?;瘜W(xué)成分和代謝物的綜合研究方法是很有必要的。
在UPLC-Q-TOF-MS分析之后,我們可以使用非靶向特征過濾分析和在計算機預(yù)測策略(NCFS)中有效地識別中藥和生物樣品中可能存在的化學(xué)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物。非靶向特征濾波器分析是多重質(zhì)量缺陷濾波器(MMDF)、片段和中性損失濾波器(FNLF)、診斷片段離子濾波器(DFIF)、產(chǎn)物離子濾波器(PIF)、氮規(guī)則濾波器(NRF)的統(tǒng)稱,而在計算機預(yù)測策略中需要使用三個數(shù)據(jù)庫來預(yù)測代謝物:BioTransformer(http://biotransformer.ca/new)、GLORYx (https://nerdd.univie.ac.at/)和EAWAGPPS (http://eawag-bbd.ethz.ch/)[9,10]。該整合策略具有高靈敏度、高精度和高分辨率的特點,可用于大鼠給藥后不同生物樣品中原型及其代謝物的成分分析。研究達(dá)立通顆粒的體內(nèi)外化學(xué)成分及可能的代謝物,為深入研究達(dá)立通顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù),促進(jìn)其現(xiàn)代化發(fā)展。
2.實驗
2.1.材料和試劑
甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)(HPLC級)購自默克公司(Darmstadt,Germany),甲酸(FA)(LC-MS級)購自Aladdin (Shanghai,China)。使用Milli-Q系統(tǒng)(Millipore,Bedford,MA,USA)進(jìn)行超純水凈化。達(dá)立通顆粒(批號:210342)由南昌弘益藥業(yè)有限公司生產(chǎn)、提供。
Saikosaponin A和Saikosaponin D來自Mansite生物技術(shù)有限公司(中國成都)。檳榔堿、綠原酸、阿曲柳苷、原兒茶酸、雞皮苷、黃連堿、麻瓜堿、巴馬汀、黃連素、原托堿、傘形花酮、牡荊素4”-o-葡萄糖苷、金菊素、異綠原酸B、二氫車菊堿均來自成都普飛德生物科技有限公司。橙皮苷、木犀草素、芹菜素購自上海源業(yè)生物科技有限公司。槲皮素、蘆丁購自中國食品藥品檢定研究院,1-咖啡??鼘幩?、大麥芽堿、咖啡酸、金絲桃苷、阿魏酸、聚氰胺糖苷、甲基橙皮苷、橙皮苷、木質(zhì)素內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、花青素,檸檬素、山柰素、橙皮素、黃芩苷、山奈酚、四氫巴馬汀、柚皮苷、奧拉蓬素購自中國成都中草藥有限公司。
2.2.儀器和UPLC條件
UPLC-Q-TOF/MS/MS(AB SCIEX)分析系統(tǒng)由UPLC系統(tǒng)(LC-20A,Shimadzu)耦合到配備電子噴霧電離(ESI)的四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(AB SCIEX)組成。采用Hypersil GOLDTM色譜柱(3 m,2.1 mm 100 mm),柱溫40℃,流速0.4 mL/min。流動相A為水和FA(0.1%, v/v),流動相B為乙腈。洗脫過程按以下梯度進(jìn)行:0-2分鐘,5% B;2-25分鐘,60% B;25-28分鐘,90% B;28-30分鐘,90% B;30-32分鐘,5% B;32-36分鐘,0。進(jìn)樣量為3 μL。
質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下:正離子/負(fù)離子模式下掃描范圍均為m/z 50- 1500。帷幕氣(GUR)為40 psi;霧化氣體(GS1)和輔助氣體(GS2)均為55 psi;離子噴霧電壓設(shè)置為5500 V/-5500 V;碰撞能量為10 V或-10 V;去簇電壓為100 V/-100 V;ESI溫度為550℃。
2.3.達(dá)立通顆粒的萃取
取達(dá)立通顆粒2.875 g,相當(dāng)于藥材5 g,加入80%甲醇10 mL,振蕩30 min,離心10min,取上清液。用真空離心濃縮器(Thermo Scientific)將上清液在45℃下干燥,殘渣在800 μL甲醇中重新溶解,確保最終濃度為6.25 g粗品/mL。
2.4.動物和給藥
雄性SD大鼠8只(180~220g),由杭州醫(yī)學(xué)院(中國浙江)提供。實驗動物許可證編號為SYXK(浙)-2019-0002。所有動物治療均根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院的《實驗動物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。動物研究方案經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)期刊動物倫理委員會預(yù)審?fù)ㄟ^。
這些大鼠被安置在標(biāo)準(zhǔn)條件下(室溫22±2℃;相對濕度55±5%;并在一周內(nèi)進(jìn)行12小時的明暗交替循環(huán)),允許自由進(jìn)食和飲水。根據(jù)實驗需要,給藥前將大鼠隨機分為兩組(n = 4/組),對照組和達(dá)立通顆粒治療組。達(dá)立通顆粒治療組取2只大鼠血漿樣本,另取2只大鼠尿、糞樣本。每天灌胃1次(上午8:30均勻灌胃),按11.2 g/kg生藥(約為臨床劑量的4倍)灌胃7天,有利于大鼠生物樣本中發(fā)現(xiàn)更多吸收的原型物和代謝物。同時,對照組大鼠灌胃等量水。
2.5.樣品預(yù)處理
在最后一次給藥后的0.5、1、2、4、6、8 h,用肝素化離心管采集眼靜脈血液樣本。在5000 rpm離心10 min后收集上清液,將0.5 h和1 h、2 h和4 h、6 h和8 h的上清組合液為血漿1(P1)、血漿2(P2)和血漿3(P3)。不同時期的血漿樣本采集和組合的目的是檢測出更多的血漿原型和代謝物。加入3倍乙腈沉淀血漿中的蛋白質(zhì)后,上清液蒸發(fā)至干燥,加入200 μL甲醇溶解殘渣。最后,在4℃,12,000 rpm離心10分鐘,將上清液注入UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)。
末次給藥(等劑量水)后,將兩組大鼠分別放入代謝籠中收集尿液和糞便。將尿樣與超純水按1:1混合,共3ml,5000轉(zhuǎn)離心10分鐘,取上清液。將上清液蒸發(fā)至干燥,再加入200 μL甲醇溶解殘渣。最后,在4℃,12,000 rpm離心10分鐘,將上清液注入UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)。
糞便樣品,將0.2 g糞便加入0.8 mL 80%乙腈中,旋渦10分鐘,以5000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,得到上清液。上清液蒸發(fā)至干,用200 μL甲醇溶解殘液。最后,在4℃,12,000 rpm離心10分鐘,將上清注入UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)。
同樣的,采集大鼠的胃、肝、腎、空腸和結(jié)腸。2 mL EP管中各取0.2 g,加入0.8mL 80%乙腈研磨成勻漿。離心后收集上清液并干燥,加入200 μL甲醇溶解。12000 rpm離心10 min后收集上清,注入UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)。
3.結(jié)果與討論
3.1達(dá)立通顆?;瘜W(xué)成分的鑒定
UPLC-Q-TOF-MS/MS分析系統(tǒng)結(jié)合非靶向特征濾波分析和計算機預(yù)測策略(NCFS)的化學(xué)成分體內(nèi)外鑒定主要包括四個步驟,具體信息見圖1[11,12]。首先,采用UPLCQ-TOF-MS進(jìn)行數(shù)據(jù)采集;與信息依賴采集(IDA)測試相對應(yīng)的結(jié)合動態(tài)背景減法(DBS)設(shè)置的在線數(shù)據(jù)采集方法,能夠高效、靈敏地區(qū)分背景干擾離子和目標(biāo)離子[13,14]。通過上述步驟,結(jié)合文獻(xiàn)和TCMSP數(shù)據(jù)庫[15],建立了包含保留時間、主要片段離子等多種質(zhì)譜信息的達(dá)立通顆?;瘜W(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。其次,在PeakView software aretm TM(AB SCIEX)應(yīng)用的基礎(chǔ)上,總結(jié)了主要參考物質(zhì)的破碎規(guī)律。采用離子色譜(XIC)提取和質(zhì)譜特征過濾功能,包括片段和中性損失過濾器(FNLF)、診斷片段離子過濾器(DFIF)、產(chǎn)物離子過濾器(PIF)和氮規(guī)則過濾器(NRF),對采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)[16]進(jìn)行分析。該步驟可以提供準(zhǔn)確的MS2信息,以快速有效地篩選目標(biāo)化合物并推測目標(biāo)化合物的部分代謝物。第三步,利用BioTransformer、GLORYx和EAWAG-PPS[17]對達(dá)立通顆粒的代謝物進(jìn)行預(yù)測。利用Peakview SoftwareTM(AB SCIEX)對不同生物樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)合文獻(xiàn)報道,采用多重質(zhì)量缺陷濾波(MMDF)、片段和中性損失濾波(FNLF)、診斷片段離子濾波(DFIF)、產(chǎn)物離子濾波(PIF)和氮規(guī)則濾波(NRF)策略。并利用上述步驟中發(fā)現(xiàn)的原型物質(zhì)的破碎規(guī)律和大鼠口服達(dá)立通顆粒后產(chǎn)生的代謝物進(jìn)行初步鑒定。最后,在文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上,結(jié)合上述鑒定的原型和代謝物,對達(dá)立通顆粒中不同類型化學(xué)成分的代謝途徑進(jìn)行總結(jié)[18-20]。
達(dá)立通顆粒中鑒定出的化學(xué)成分及相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表S1。在達(dá)立通顆粒中共檢出108種化合物,其中類黃酮50種,生物堿22種,萜類13種,有機酸11種,香豆素10種,揮發(fā)油2種。其中43個化合物通過與對照物的保留時間和主要片段離子的比較,進(jìn)一步得到了明確的確認(rèn)。達(dá)立通顆粒在正離子(A)和負(fù)離子(B)模式下的基峰色譜(BPC)如圖2所示。達(dá)立通顆粒的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)配方分類如圖3所示。圖4為達(dá)立通顆粒中四種典型化合物(柚皮苷4’-葡萄糖苷、氫化小檗堿、雞矢藤甙酸和奎寧酸)的提取離子色譜圖、MS/MS光譜和解理圖,對其代謝產(chǎn)物的推測和驗證具有重要意義。
3.1.1類黃酮
采用UPLC-Q-TOF-MS 法測定達(dá)立通顆粒中黃酮類化合物含量為20種。而本研究通過PIF、FNLF和DFIF策略,發(fā)現(xiàn)并鑒定了50種黃酮類化合物,包括黃酮苷元、黃酮O-糖苷和黃酮C-糖苷[21]。黃酮苷元的裂解模式主要有兩大類。類黃酮C環(huán)上典型的反向- diels -alder(RDA)反應(yīng)可產(chǎn)生診斷離子。通過比較化合物的產(chǎn)物離子和診斷離子的元素差異,推測類黃酮取代基的位置和類型。此外,中性分子(CH3、CO和CO2)的丟失可以產(chǎn)生識別化合物[22]的特征產(chǎn)物離子。例如,甲烷的丟失是甲氧基黃酮類化合物的特征。除了上述兩種主要的裂解模式外,黃酮O-糖苷還可以通過失去糖苷鍵產(chǎn)生片段離子。146 Da、162 Da和176 Da的丟失表明分別存在O-鼠李糖(Rha)O-糖苷(Glc)和葡萄糖醛酸酯(Glu)[23]。此外,O-糖基黃酮的片段離子主要由糖環(huán)的裂解產(chǎn)生,包括中性片段(90 Da、150 Da)的丟失和診斷離子片段(120 Da)的丟失。因此,黃酮O苷和黃酮C苷可以通過不同的片段離子來區(qū)分。
化合物43(C27H32O14,tR=9.115 min)的光譜顯示為m/z 581.1855 [M+H]+準(zhǔn)分子離子,產(chǎn)物離子m/z 435.1292 [M+H- Rha]+,273.0756 [M+H- Rha - Glc]+和診斷離子153.0184 [M+H- Rha - Glc - C8H8O]+?;衔?/span>49(C27H32O14,tR=9.408 min)產(chǎn)生一個m/z 581.1856 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子,在MS2中檢測到診斷離子m/z 273 [M+H- Rha -Glc]+。這兩種化合物的片段離子基本是相同的[24]。結(jié)合文獻(xiàn)報道,柚皮苷蕓香苷是一種與柚皮苷苷元連接的蕓香苷,它更傾向于去除末端的鼠李糖的一個分子,與葡萄糖殘基生成苷元離子m/z 435。因此,m/ z435離子片段的相對豐度較高;柚苷是一種與柚皮苷苷元連接的新橙皮糖。同時容易去除雙糖,因此m/ z273離子片段相對豐度較高。因此,推測C43為柚皮蕓香苷, C49為柚苷。
化合物30(C33H42O19,tR=7.946 min)(圖4a)在m/z 743.2404 [M+H]+和m/z 741.2240 [M-H]-處分別為準(zhǔn)分子離子。產(chǎn)物離子在m/z 435.1278 [M+H-Glc-Rha]+,417.1170 [M+H-Glc - Rha- H2O]+和診斷離子273.0755 [M+H-2Glc-Rha]+、153.0176(1,3A -)[M+H-2Glc-Rha-C8H8O]+以正離子模式存在,片段離子M /z 621.1672 [M- H]-和診斷離子M /z 271.0591 [M-H-2Glc-Rha]-、151.0029(1,3A-) [M-H-2Glc-Rha-C8H8O]-以負(fù)離子模式存在。因此,推測C30為柚皮蕓香苷 4 -葡萄糖苷[24]?;衔?/span>53 (C28H34O15,tR=9.646 min)為m/z 611.1961 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子。檢測到的片段離子為m/z 465.1387 [M+H- Rha]+、303.0862 [M+H - Rha - Glc]+、177.0550 [M+H - Rha - Glc-C6H6O3]+、153.0187 [M+H-Rha-Glc- C9H10O2]+(診斷離子)。將C53與對照物的片段信息進(jìn)行比對,鑒定為橙皮苷[25]。
化合物79(C15H10O5,tR=12.986 min)表現(xiàn)為m/z 271.0600 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子。產(chǎn)物離子位于m/z 243.0603 [M+H-CO]+、153.0176 [M+H-C8H6O]+ (1,3A-)(診斷離子)和119.0502 [M+H-C7H4O4]+ (1,3B -)(互補片段離子),這是黃酮類化合物C環(huán)X1,3裂解產(chǎn)生的特征離子片段。這意味著在A環(huán)上有兩個羥基取代,在B環(huán)上有一個羥基取代。通過與對照物的片段信息比較,C79被鑒定為芹菜素[24]。
3.1.2.生物堿類
本研究從達(dá)立通顆粒提取液中鑒定出23種生物堿和其他含氮化合物,主要來自延胡索和雞矢藤。氮規(guī)則是指不含氮或偶氮的有機質(zhì)相對分子質(zhì)量為偶,含奇氮的有機質(zhì)相對分子質(zhì)量為奇,可用于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的過濾。根據(jù)氮規(guī)則,有些生物堿更容易生成一個易于檢測的準(zhǔn)分子離子[M]+,有些生物堿在正離子模式下生成一個準(zhǔn)分子離子[M+H]+,而失去含氮基團(tuán)。此外,PIF、DFIF和FNLF策略仍然適用于生物堿的鑒定?;衔?(C8H13NO2,tR=0.953 min)在m/z 156.1019[M+H]+處生成準(zhǔn)分子離子。產(chǎn)物離子在m/z 138.0570 [M+H-H2O]+,124.0753 [M +H-OCH3]+和1313.0584[M + H-C2H6N] +被發(fā)現(xiàn)。因此,通過與對照物的片段信息比較,推斷C1為檳榔堿。化合物57 (C20H21NO4,tR=9.906 min)(圖4b)為m/z 340.1544 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子。176.0712 [M+H-C10H12O2]+(豐度最高的片段離子和診斷離子)、165.0914 [M+H-C10H9NO2]+(互補片段離子)和149.0607 [M+HC11H13NO2]+的產(chǎn)物離子證實了典型的RDA-解離特征,這是由于苯甲酰氧基和含氮基團(tuán)的連續(xù)丟失。通過與對照物的片段信息比較,確定其為氫化小檗堿。
3.1.3.萜類
本研究從達(dá)立通顆粒中鑒定出13個萜類化合物,包括倍半萜、環(huán)烯醚萜和三萜皂苷(五環(huán)三萜苷)。雞矢藤的主要成分是萜類化合物,如芍藥苷、單肌豆苷、曲柳苷和芍藥苷酸(圖4c)等。部分萜類化合物優(yōu)先失去中性的小分子,包括H2O、CO2、CH3和CO,部分皂苷會先失去糖苷變成小分子。146 Da和162 Da的丟失表明O-焦點和O-糖苷的存在。因此,利用FNLF和PIF的策略可以對萜類[26]進(jìn)行過濾和識別。如C2、C23、C104和C105為萜類化合物,其特征片段表現(xiàn)為CO2和H2O的中性損失?;衔?(C16H22O11,tR=1.146 min)在m/z 389.1088 [M-H]-范圍內(nèi)生成準(zhǔn)分子離子。在MS2中可以檢測到m/z 227.0545 [M-H -Glc]-、209.0439 [M-H-Glc-H2O]-、191.0334 [M-H-Glc-2H2O]-、183.0654 [M-H-Glc -CO2]-、179.0551 [M- H- Glc - CH4O2]-、165.0548 [M-H-Glc - C2H6O2]-、147.0447 [M-H-Glc - 2H2O]-處的產(chǎn)物離子。結(jié)合文獻(xiàn)報道,C2被鑒定為水晶蘭苷。木香內(nèi)酯(化合物104,C15H20O2,tR=20.345 min)和去氫木香內(nèi)酯(化合物105,C15H18O2,tR=20.734 min)是木香的主要成分,也屬于萜類化合物。以前者為例,C104在m/z 233.1533 [M +H]+處產(chǎn)生了一個準(zhǔn)分子離子,發(fā)現(xiàn)特征片段m/z 215.1408 [M+H- H2O]+和m/z 187.1476 [M+H-CO2-2H]+ 這是由丟失的水(18 Da)、二氧化碳和2H (46 Da)產(chǎn)生的。推測C104為木質(zhì)素內(nèi)酯,并通過與對照物的片段信息對比進(jìn)一步證實了這一點。
柴胡皂苷是柴胡的主要成分,屬于β-芳香樹脂烷基三萜。62 Da和58 Da的損失分別代表C2H6O2和C2H2O2的損失。因此,PIF、FNLF和DFIF策略同樣適用于柴胡皂苷[27]的鑒定?;衔?/span>103 (C44H70O14,tR=19.836 min)的m/z為821.4697 [M - H]-。在MS2中檢測到產(chǎn)物離子m/z為779.4620 [M-H-C2H2O]-、617.4080 [M-H - Glc - C2H2O]-和471.3490 [M-H- Glc - Fuc - C2H2O]-(診斷離子)。通過與對照物的片段信息比較,推測C103為3”- O -乙酰柴胡皂苷D [28]。
3.1.4.有機酸
采用FNLF和PIF方法,在達(dá)立通顆粒提取液中分離出11種有機酸化合物。中藥山楂的主要成分為有機酸,如綠原酸、咖啡酸、齊墩果酸、奎寧酸等(圖4d)。這些化合物在負(fù)離子模式下更容易被檢測到,主要是H2O、CO2和CH3等小分子碎片的丟失?;衔?/span>5 (C7H6O4,tR=1.877 min)為[M-H]-準(zhǔn)分子離子,m/z為153.0199。在m/z 109.0302 [M-H-CO2]-, 108.0215 [M-H-HCOO]-和91.0194 [M- H- CO2 - H2O]-處發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)物離子。因此,推測C5為原兒茶酸。
3.1.5.香豆素
從達(dá)立通顆粒中鑒定出10種香豆素。這些化合物主要從中藥枳實和山楂中分離得到,包括枳酚、傘形花酮、東莨菪素、枳烯、環(huán)氧枳烯和黃當(dāng)歸醇?;衔?1 (C17H16O6,tR=11.374 min)在M /z 317.1020處有一個[M+H]+的準(zhǔn)分子離子,該離子裂解后失去C7H10O2(126 Da),生成片段M /z 191.0701,失去C9H8O3 (164 Da),得到特征片段M /z 153.0176。通過與文獻(xiàn)報道的片段信息對比,推測化合物71為甜菊糖。
化合物78(C19H22O4,tR=12.588 min)在M /z 315.1593處有一個[M+H]+準(zhǔn)分子離子,通過母離子裂解損失的C9H16O (140 Da)、C10H16O(152 Da)和C9H6O3(162 Da)得到M /z 175.0366、163.0385和153.1271處的特征片段離子。比較片段信息,推測C78為環(huán)氧枳烯。
3.1.6.其他化合物
質(zhì)譜分析結(jié)果表明,達(dá)立通顆粒提取液中含有兩種揮發(fā)油化合物?;衔?/span>87 (C10H14,tR=14.608 min)為[M+H]+準(zhǔn)分子離子,M/z為135.1167。m/z為91.0556 [M+H-C3H8]+和77.0403 [M+H-C4H10]+的片段離子,結(jié)合文獻(xiàn)報道,推測C87為p-傘花烴。
3.2.體內(nèi)吸收成分和代謝物的鑒定
首先,以達(dá)立通顆粒提取液的鑒定結(jié)果為基礎(chǔ),采用XIC法對大鼠吸收的原型化合物進(jìn)行鑒定;接下來,在計算機代謝物預(yù)測中預(yù)測吸收的原型化合物的潛在代謝物,包括BioTransformer、gloria和EAWAG-PPS[10]。前兩者可以預(yù)測I相和II相代謝的產(chǎn)物,最后一個可以預(yù)測化合物可能的生物降解,包括常見的代謝轉(zhuǎn)化。采用PeakView SoftwareTM和XIC軟件對預(yù)測的代謝物進(jìn)行識別,并與原型和文獻(xiàn)進(jìn)行比較,確定的準(zhǔn)確質(zhì)量、保留時間和片段離子,采用MMDF、DFIF、PIF和FNLF策略進(jìn)行篩選。最后,推導(dǎo)出可能的代謝途徑[29]。
通過上述步驟,在生物信息學(xué)預(yù)測中總共預(yù)測了978種可能的代謝物。然后,我們使用MMDF過濾不同生物樣品中的潛在代謝物[30]。將原型的公式輸入PeakView SoftwareTM,然后分別設(shè)置不同的MDF模板,包括原型、葡萄糖醛酸化、硫酸化等[31]。接下來,通過可能的代謝途徑和質(zhì)量缺陷耐受性過濾代謝物。I相和II相代謝物的缺陷通常設(shè)置為±50 mDa,每個模板窗口的缺陷窗口設(shè)置為100 mDa。此外,還利用DFIF、PIF和FNLF功能對體內(nèi)代謝物進(jìn)行鑒定和確認(rèn)。不同類型代表化合物的質(zhì)譜信息包括準(zhǔn)確質(zhì)量、保留時間、特征片段和診斷離子在內(nèi)的可用于過濾代謝物。例如,273/271(C15H12O5)和153/151(C7H4O4)是類黃酮代謝物碎片產(chǎn)生的兩個重要碎片離子,包括正離子和負(fù)離子模式下的羥基化產(chǎn)物、葡萄糖醛酸結(jié)合物和硫酸鹽結(jié)合物。最后,如表S2所示,大鼠灌胃達(dá)立通顆粒后發(fā)現(xiàn)60種原型化合物和87種代謝物,包括80種黃酮類化合物、29種萜類化合物、21種生物堿、10種有機酸和7種香豆素。此外,結(jié)果表明,大鼠胃、血漿、肝臟、腎臟、空腸、結(jié)腸、尿液和糞便中的原型化合物和代謝物的數(shù)量存在差異。一方面這可能是由于大鼠生物樣本中發(fā)現(xiàn)的化合物濃度和MS片段的豐度不同所致。另一方面,達(dá)立通顆粒中不同類型化合物的首選代謝器官和代謝途徑可能不同。例如,I相主要發(fā)生在肝臟[32]。達(dá)立通顆粒中六種典型代謝物的提取離子色譜、MS/MS譜和裂解模式(柚皮苷的硫酸化和葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物、芹菜素的甲基化代謝產(chǎn)物、巴馬汀的去甲基化、羥基化和葡醛酸代謝物、巴馬汀的去甲基代謝產(chǎn)物、氨甲酰糖苷的去糖基化代謝產(chǎn)物以及柴胡皂苷D的去糖基化和去甲基化為羧酸代謝產(chǎn)物)如圖5所示。
3.2.1.體內(nèi)原型成分的鑒定
在大鼠的生物樣品中發(fā)現(xiàn)了60種原型成分,包括33種黃酮類化合物、11種生物堿、7種萜類化合物、6種香豆素和3種有機酸。血漿中發(fā)現(xiàn)了21種原型成分,包括原兒茶酸(P5)、氰菊酯(P35)、黃連素(P45)、李寧(P48)、四氫巴馬?。≒52)、橙皮苷(P53)、地奧司明(P54)、芍藥苷(P63)、木犀草素(P70)、櫻皮素(P73)、異櫻皮苷(P76)、環(huán)氧烏拉pten(P78)、芹菜素(P80)、3',7-二甲基槲皮素(P81)、鼠李素(P84)、環(huán)氧麥角菌素(P86)、5-6-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮(P91)、桂皮素(P94)、5-6-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮(P101)、木香內(nèi)酯(P104)、和脫氫殼內(nèi)酯(P105),這表明黃酮類化合物是主要的口服達(dá)立通顆粒后吸收有效成分。此外,在胃中發(fā)現(xiàn)51種代謝物,在肝臟中發(fā)現(xiàn)8種,在腎臟中發(fā)現(xiàn)15種,在空腸中發(fā)現(xiàn)16種,在回腸中發(fā)現(xiàn)11種,在尿液中發(fā)現(xiàn)39種,在糞便中發(fā)現(xiàn)16個。圖S1顯示了空白組大鼠血漿樣品和服用達(dá)立通顆粒的血漿樣品通過UPLC-Q-TOF-MS顯示的正離子模式和負(fù)離子模式下的基峰色譜圖(BPC)。從圖S2到圖S8可以看到其他生物樣品的正離子模式和負(fù)離子模式基峰色譜圖(BPC),包括組織樣本、尿液樣本和糞便樣本。
3.2.2.體內(nèi)類黃酮相關(guān)成分的鑒定
類黃酮是達(dá)立通顆粒的主要成分,在大鼠的生物樣品中鑒定出80種類黃酮相關(guān)原型和代謝物。如圖6所示,發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物的主要代謝途徑為甲基化、乙?;⒒腔推咸烟侨┧峄?/span>[33]。例如,根據(jù)m/z 271.0617[M-H]-,151.0033[M-H-C8H8O]-處的診斷離子和m/z 119.0505[M-H-C-C7H4O4]-處的碎片離子,P77(C15H12O5,tR=12.524 min)被推斷為柚皮素。結(jié)果表明,通過設(shè)置硫酸化和葡萄糖醛酸化兩種MDF模板,M23(C21H20O14S,tR=8.307 min)的光譜在M/z 527.0501處具有準(zhǔn)分子離子[M-H]-。m/z 447.090,2351.0093處的碎片離子和MS2光譜中的診斷離子271.0580表明SO3和Glu損失。因此,M23被推斷為葡萄糖醛酸化和硫酸化P77的代謝物。
P79(C15H10O5,tR=12.563 min)根據(jù)其在m/z 271.0601[M+H]+(診斷離子)和243.0648[M+H-CO]+(正離子模式)以及269.0456[M-H]-(負(fù)離子模式)的片段離子推斷為芹菜素。m/z 153.0190[M+H-C8H6O]+下的產(chǎn)物離子(診斷離子)和119.0521[M+H-C7H4O4]+通過RDA反應(yīng)得到,表明A環(huán)上有羥基雙取代基,B環(huán)上有羥單取代基[20,24]。MDF發(fā)現(xiàn)M51的準(zhǔn)分子離子(C16H12O5,tR=11.062 min)(圖5B)比P79高14 Da,M40的片段離子167.0309比P79的診斷離子153.0190高14 Da,表明甲基化結(jié)合位點位于A環(huán)上[15]。因此,M51可能是P79的甲基化代謝產(chǎn)物,代謝物M31(C21H18O11,tR=9.004 min)在m/z 445.0766[m-H]處顯示出準(zhǔn)分子離子,比P79高176 Da,其在m/z 269.0447和254.0229處的MS2產(chǎn)物離子對應(yīng)于負(fù)離子模式下的P79。因此,M31是P79的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。如表S2所示,總結(jié)了生物樣品中類黃酮相關(guān)原型和代謝物的詳細(xì)信息。
3.2.3.體內(nèi)生物堿相關(guān)成分的鑒定
共鑒定出23種生物堿相關(guān)原型和代謝物,主要存在于胃和尿液中。如圖7所示,發(fā)現(xiàn)生物堿的主要代謝途徑是氫化、羥基化、葡萄糖醛酸化、去氫、去甲氧基化和環(huán)裂解。例如,C64(C21H22NO4+,tR=10.608 min)通過其在m/z 352.1543[M]+、336.1230[M-CH4]+、322.1072[M-2CH3]+(診斷離子)、308.1284[M-CH4-CO]+和119.0505[M-H-C7H4O4]-處的產(chǎn)物離子推斷為巴馬汀。同樣,使用不同的MDF窗口和PIF、FNLF和DFIF策略過濾生物堿相關(guān)代謝物。MDF計算表明,代謝產(chǎn)物M35(C20H20NO4+,tR=9.442 min)(圖5D)比C64低14 Da,M54(C21H20NO4],tR=11.420 min)比C64低2 Da。M35在m/z 338.1392[M]+處顯示出準(zhǔn)分子離子。在m/z 322.1073和294.1133處發(fā)現(xiàn)的碎片離子源于母體離子的16 Da(-CH4)和28 Da(-CO)的連續(xù)損失。因此,M35被推斷為巴馬汀的脫甲基產(chǎn)物。M54的主要碎片離子位于m/z 350.1367[M]+、306.1324[M-CH4-CO]+,表明M54可能是巴馬汀的脫氫產(chǎn)物。此外,代謝物M27(C25H28NO11+,tR=8.472 min)(圖5C)比巴馬汀高166Da。M27在m/z 518.1662[M]+處顯示出準(zhǔn)分子離子。在m/z 342.1335和324.1147處發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物離子,其來源于母體離子連續(xù)損失176 Da(-Glu)和18 Da(-H2O)。m/z處發(fā)現(xiàn)的碎片離子176.0714[M-Glu-C10H14O2]+(診斷離子),提示M27可能是C64的雙脫甲基、羥化酶和葡萄糖醛酸化產(chǎn)物[34]。
3.2.4.體內(nèi)萜類相關(guān)成分的鑒定
共鑒定出30種萜類相關(guān)原型和代謝物,主要存在于胃、尿液和糞便中。萜類主要包括倍半萜內(nèi)酯、環(huán)烯醚萜和三萜皂苷。如圖8所示,在本研究的數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)萜類化合物的主要代謝途徑是氫化、脫糖基化和脫氫。以代謝物M72(C36H56O10,tR=19.012 min)(圖5F)為例,顯示了鑒定過程。M72的光譜在M/z 647.3784處顯示出[M-H]-準(zhǔn)分子離子。在m/z 471.3491處發(fā)現(xiàn)診斷離子,根據(jù)母體離子顯示損失176 Da(-Fuc-2O+2H)。MMDF計算表明,柴胡皂苷D在M/z 779.4562處顯示出[M-H]-準(zhǔn)分子離子,比在M72的MS2光譜中發(fā)現(xiàn)的M/z 647.3784高132Da。在m/z 617.4080和m/z 471.3491處發(fā)現(xiàn)診斷離子,其來源于母體離子的162 Da(-Glc)和146 Da的連續(xù)損失。因此,M72被確定為柴胡皂苷D的脫糖基和脫甲基反應(yīng)生成羧酸(-2H+2O)產(chǎn)物。
4.結(jié)論
利用UPLC-Q-TOF-MS/MS和NCFS技術(shù),我們在達(dá)立通顆粒中鑒定出108種化學(xué)成分;在大鼠口服達(dá)立通顆粒后的生物樣本中共推測出147種化學(xué)成分(60種原型化合物和87種代謝物)。我們的數(shù)據(jù)將有助于深入研究達(dá)立通顆粒可能的藥理物質(zhì)基礎(chǔ)。
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